L_亮氨酸發(fā)酵用糖蜜預(yù)處理方法研究

    分析了糖蜜中影響發(fā)酵產(chǎn)生L-亮氨酸的不利因素。為除去影響發(fā)酵產(chǎn)生L-亮氨酸的各種雜質(zhì)，重點(diǎn)研究了幾種糖蜜預(yù)處理方法，對(duì)預(yù)處理前后糖蜜中各種糖分和鈣離子含量進(jìn)行了分析確定。并將預(yù)處理后糖蜜進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，根據(jù)菌種生長(zhǎng)情況和發(fā)酵產(chǎn)生L-亮氨酸的含量，最終確定硫酸法為最佳糖蜜預(yù)處理方法。
關(guān)鍵詞：甘蔗糖蜜 預(yù)處理 分析 測(cè)定 發(fā)酵 L-亮氨酸發(fā)酵：

    在發(fā)酵工業(yè)上所謂的糖蜜，主要是指制糖工業(yè)上不能再用于煮制糖品的廢糖蜜（waste molasses）。甘蔗糖蜜含糖量高，是很好的發(fā)酵原料。目前國(guó)內(nèi)外常以糖蜜為原料發(fā)酵生產(chǎn)酒精、谷氨酸、酵母、抗生素和飼料等。
    廣西是全國(guó)甘蔗生產(chǎn)基地，甘蔗糖蜜的資源豐富，價(jià)格低廉，是發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的很好的碳源。但糖蜜不經(jīng)處理直接稀釋發(fā)酵時(shí)有以下原因影響發(fā)酵：①因其中含有剩余金屬離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能促使菌體過(guò)渡生長(zhǎng)，阻礙產(chǎn)酸；②含有過(guò)剩生物素，需要抑制其作用的添加物，這就比淀粉水解發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的工藝復(fù)雜；③糖蜜含有黑褐色色素，影響成品色澤；④含有膠體物質(zhì)，粘度大，致使發(fā)酵中泡沫過(guò)多，對(duì)于提取也帶來(lái)困難；⑤含有較多的鈣質(zhì)物質(zhì)，這對(duì)于L-亮氨酸的提取很不利，以上種種原因致使L-亮氨酸產(chǎn)量往往很低。因此，對(duì)遠(yuǎn)糖蜜進(jìn)行預(yù)處理對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸具有重要意義。
    1  材料方法
    1.1材料
    蔗糖糖蜜：含糖量50%左右，錘度約為54°Bx；黃色短桿菌（Brevibact eriu mflavum）L-422。
    1.1.1主要試劑
    （1）化學(xué)試劑：所有試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)。0.85%生理鹽水：0.85gNaCl溶于100g蒸餾水中。6mol/L煙酸：取50ml濃鹽酸倒入50ml蒸餾水中，混勻即可。20%NaOH溶液：20gNaOH溶于80g蒸餾水中。活性炭。
    （2）活化斜面（g/L）：葡萄糖20，牛肉膏5，蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 2.5，瓊脂20；滅菌條件：115℃存放25min；pH為7.7.
    1.1.2主要儀器設(shè)備
    SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析儀；高速臺(tái)式離心機(jī)；微量可調(diào)取樣器；HWY-2112型落地式雙層全溫度恒溫調(diào)速培養(yǎng)搖床；PHS-25A型數(shù)字酸度計(jì)；90L，628B-2型立式壓力蒸汽消毒器；漩渦混合器；LRH-250-Ⅱ微電腦控制生化培養(yǎng)箱。
    1.2實(shí)驗(yàn)方法
    1.2.1分析方法
    （1）菌種生長(zhǎng)測(cè)定（吸光度法）：用可調(diào)微量移液器吸取0.5ml菌液于小離心管中，在8000rpm條件下離心2min，棄上清液留沉淀菌種，加蒸餾水震蕩懸浮，移入10ml比色管中，加水定量至10ml，震蕩均勻后用754-紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)為620nm下的吸光度（OD值）。
    （2）殘?zhí)牵ㄆ咸烟牵┑臏y(cè)定:吸取發(fā)酵液0.5ml離心后，取上清液0.1ml移入10ml比色管中后，加蒸餾水定量至10ml刻度線，搖勻后用SBA-40C型葡萄糖-谷氨酸分析儀測(cè)定其殘?zhí)羌雌咸烟呛俊?br />    （3）L-亮氨酸及L-纈氨酸的測(cè)定：采用紙色譜-色斑洗脫比色法測(cè)定。
    （4）糖蜜中各種糖分的測(cè)定：采用斐林試劑法測(cè)定。
    （5）鈣離子測(cè)定：采用EDTA法測(cè)定。
    （6）酸度的測(cè)定：數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定。
    （7）錘度的測(cè)定：用錘度計(jì)測(cè)定。
    1.2.2處理方糖蜜預(yù)法
    （1）澄清法：用乙酸鋅-亞鐵氰化鉀溶液做澄清劑，在50-75ml樣品液中加入乙酸鋅溶液[21.9gZn（CH₃COO）₂·2H₂O/L]和亞鐵氰化鉀（10.6%）各5ml，靜置沉降，待澄清劑沉淀完全，再用3000rpm離心機(jī)分離5min，取上清液繼續(xù)處理。澄清法為糖蜜預(yù)處理的第一步，然后用下面的5種處理方法進(jìn)一步對(duì)糖蜜預(yù)處理。用處理后的糖蜜作為碳源，用以搖瓶發(fā)酵。
    （2）硫酸處理法：糖蜜加水，質(zhì)量比1：1，再加硫酸，調(diào)pH至2.0，于95-100℃加熱20min，使膠體分離，并促使蔗糖轉(zhuǎn)化，也可以在此時(shí)驅(qū)除可能存在的有礙于菌體的亞硝酸，然后用14%石灰乳中和處理。由于生成大量的石膏，以及鈣離子的置換作用，可除去大量的鉀、鈉等金屬元素，從而得到澄清糖液。
    （3）石灰處理法：糖蜜加水，質(zhì)量比1：1，加15%新鮮石灰乳，調(diào)節(jié)pH8-pH9，加熱至100℃，煮沸30min，使膠體破壞，然后以硫酸中和，靜置澄清數(shù)小時(shí)，得到澄清透明的糖液。
    （4）活性炭法：糖蜜經(jīng)1：1加水稀釋后，經(jīng)顆�；钚蕴课教幚�，過(guò)濾，濾液供試驗(yàn)。
    （5）磷酸處理法：糖蜜經(jīng)1：1水稀釋后，加熱煮沸，過(guò)濾，濾液中加濃磷酸調(diào)pH2.0-pH3.0，靜置澄清，過(guò)濾，濾液加入新配制的石灰乳調(diào)至pH6.0左右，65℃-7-℃保溫30min，同時(shí)加濾液重量的0.8%活性炭，過(guò)濾，濾液供試驗(yàn)。
    （6）煮沸處理法：糖蜜經(jīng)過(guò)澄清處理后，加熱煮沸20min，4000rpm離心5min，取上清液供試驗(yàn)。
    1.2.3搖瓶發(fā)酵方法
    （1）發(fā)酵前準(zhǔn)備  分別用硫酸法、石灰法、磷酸發(fā)、煮沸法、活性炭預(yù)處理糖蜜，測(cè)定原糖蜜及預(yù)處理后各種糖液中的總糖含量，分別取50g至500ml錐形瓶中（調(diào)總糖含量至10%即50g糖蜜溶液中含有5g總糖）、稱(chēng)取0.85gNaCl配成0.85%的生理鹽水，再與6mol/L HCl、20%的NaOH和預(yù)處理后的6種糖液分別用高溫滅菌鍋控溫至115℃，滅菌25min。
    （2）菌種活化  取1支冷藏于4℃冰箱中的L-亮氨酸高產(chǎn)斜面保藏菌種和10支活化斜面培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)箱中升溫至室溫。在無(wú)菌室里，將已活化的菌種劃線接種到活化斜面培養(yǎng)基上，然后放到28℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)20-24h。
    （3）搖瓶發(fā)酵  在無(wú)菌室里，用6mol/L的NaOH調(diào)預(yù)處理后各種糖液中的pH值至7.2-7.5.再用已滅菌的生理鹽水沖洗斜面培養(yǎng)基上的菌種（每支培養(yǎng)基用1ml生理鹽水），洗下的菌液混勻后，預(yù)處理后的6種糖液各加1ml菌液，搖勻取樣，九層紗布封口，置搖床開(kāi)始搖瓶發(fā)酵（搖床控制在T=28℃，轉(zhuǎn)速240rpm），發(fā)酵至菌種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。
    2結(jié)果與討論
    2.1糖蜜預(yù)處理前后主要成分含量的變化
采用1.1.2中的方法對(duì)糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理前后糖蜜中的總糖、葡萄糖及鈣離子含量如表1.